Búsqueda y caracterización biofísica de regiones membranotrópicas de las proteínas estructurales de HCV. Búsqueda de inhibidores de la entrada del virus

Abstract

El virus de la hepatitis C (HCV) es el agente causal de enfermedades hepáticas humanas tanto crónicas y como agudas, incluyendo entre éstas, hepatitis crónicas, cirrosis y hepatocarcinomas (Penin et al., 2004; Tan et al., 2002). En todo el mundo hay entre 170 y 300 millones de infectados por este virus. A pesar de su gran incidencia, no existe vacuna alguna que pueda evitar la infección viral y los agentes terapéuticos no son suficientemente eficientes para contrarrestar la enfermedad (Qureshi, 2007). El genoma viral del HCV es muy heterogéneo, por ello las regiones envueltas en los procesos de fusión de membrana o la morfogénesis de los viriones previo a la entrada y salida del virus, ambos procesos requieren interacción de las proteínas virales con las membranas, cobran en este virus más importancia, ya que las regiones implicadas en estos procesos están más conservadas en todas las estirpes. Nos propusimos como primer objetivo encontrar las regiones membranotrópicas de las proteínas estructurales del HCV para utilizarlas como dianas contra las que buscar inhibidores de interacción entre las proteína y las membranas. Esta nueva estrategia puede permitirnos encontrar nuevos agentes terapéuticos contra el HCV. Las proteínas estructurales del HCV son: la proteína core, la cual forma la nucleocápsida viral y las glicoproteínas de la envuelta E1 y E2 y la proteína p7. La proteína core está altamente conservada entre las diferentes estirpes de HCV (Cha et al., 1992). Esta proteína tiene varias funciones, sin embargo su misión más importante es el ensamblaje de los viriones y la salida viral. Nosotros hemos analizado e identificado las regiones 29-46, 57-74, 85-123 y 155-172 como las regiones membranotrópicas de la proteína core. Futuros estudios tomando como dianas estas regiones podrían permitir el desarrollo de nuevas estrategias antivirales basadas en inhibidores del ensamblaje viral. La proteína p7 es esencial para el ensamblaje y la salida eficiente de los viriones, indicando que p7 está involucrada en la fase tardía del ciclo de replicación viral (Steinmann et al., 2007). Nosotros hemos identificado el dominio del bucle entre las hélices como la región más membranotrópica de la proteína. Un péptido de 18 aminoácidos de longitudderivado de este dominio mimetiza la formación de poros cuyo tamaño está comprendido entre 6 y 23 Å, el mismo diámetro de poro que debería formar la proteína nativa. Por ello esta región puede ser esencial para la actividad del canal. De acuerdo con los resultados obtenidos, el bucle de p7 podría ser un buen candidato para desarrollar nuevas estrategias antivirales dirigidas a la fase tardía del ciclo viral. Las glicoproteínas de la envuelta viral E1 y E2 son proteínas de fusión truncadas de clase II. (Garry and Dash, 2003). Para estudiar las bases estructurales de la fusión de membranas del HCV e identificar nuevas dianas para buscar inhibidores de fusión hemos realizado un análisis de las diferentes regiones de las glicoproteínas de la envuelta E1 y E2, las cuales interaccionan con las membranas fosfolipídicas (Lavillette et al., 2006). Tras la localización de las regiones fusogénicas, hemos realizado una exhaustiva caracterización de la interacción de ellas con sistemas modelo de membrana. Hemos encontrado la región 603-634, como una de las regiones más fusogénicas de la proteína E2, la cual puede estar implicada en el proceso de fusión afectando la estructura de la membrana y ayudando en el proceso de fusión al péptido de fusión para perturbar la topología y desestabilizar la membrana del endosoma. Esto podría implicar que ambas proteínas E1 y E2 estarían directamente implicadas en el mecanismo que hace posible la entrada del virus a la célula huésped. Hemos propuesto el segmento 309-340 de la glicoproteína E1, localizado inmediatamente adyacente al dominio TM, como dominio implicado en la fusión de manera similar a los dominios PreTM de las proteínas de fusión de clase I. Un péptido derivado de esta región es capaz de unirse a la superficie de la membrana con alta afinidad y modular las propiedades biofísicas de los fosfolípidos. Su localización en la superficie le permitiría perturbar la arquitectura y desestabilizar la membrana de la envuelta viral. Para los sistemas modelo de membranas basadas en DEPE en presencia del péptido la temperatura a la cual la transición entre fase liquido cristalina y hexagonal ocurre disminuye, debido a que el péptido estabilizaría estructuras de membrana no lamelares. Estos datos sugieren que la región de E1 donde se localiza el péptido preTM puede ser fundamental para el proceso de fusión. Hemos localizado el péptido de fusión de HCV, tanto por homología con otros péptidos de fusión de otras proteínas de clase II, como experimentalmente por actividad fusogénica, en la región 274-298. Hemos observado que un péptido derivado de esta región perturba la membrana y se inserta en la interfase de la bicapa lipídica. El péptido muestra, al igual que las HCVpp, un incremento en su efecto fusogénico con la presencia de colesterol. Péptidos derivados de esta región estabilizan estructuras no lamelares de membrana, como la fase hexagonal que aparece a una temperatura inferior a la esperada en presencia de péptido. Esta región también podría ser esencial durante el proceso de fusión.Hemos estudiado diferentes regiones membranotrópicas que están directamente implicadas en el proceso de fusión. La hipótesis de partida es que si estas regiones no interaccionan con la membrana, el proceso de fusión podría no suceder y por ello el virus no entraría en la célula. Hemos intentado evitar la interacción de estas regiones membranotrópicas con otros péptidos derivados de las glicoproteínas de la envuelta. Después de varias búsquedas hemos encontrado dos péptidos inhibidores contra el péptido de fusión que reducen un 93% y 98% in vitro el efecto fusogénico de su diana. Tras esto, hemos ensayado in vivo la neutralización de la infección de estos péptidos por medio de HCVpp que expresan en la superficie las glicoproteínas de la envuelta E1 y E2, mimetizando la entrada del HCV a la célula. Los péptidos inhibidores E15 y F28 neutralizaron un 51% y 36% respectivamente la infección de HCVpp de la estirpe 1BCG a una concentración de 0.1mM. Actualmente nos encontramos intentando aumentar la afinidad del inhibidor por la región diana, sin embargo lo más importante es que un estudio exhaustivo de la interacción lipido-péptido posibilitaría el desarrollo de compuestos anti-HCV dirigidos a evitar la infección viral. Además las regiones membranotrópicas determinadas en este trabajo podrían ser utilizas como dianas terapéuticas permitiendo el desarrollo de nuevas vacunas.

Hepatitis C virus (HCV) is the leading cause of acute and chronic liver disease in humans, including chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma (Penin et al., 2004; Tan et al., 2002). There is no vaccine to prevent the HCV infection and current therapeutic agents have had a limited success against HCV infection (Qureshi, 2007). The HCV genome is widely heterogeneous; therefore, the regions implicated in fusion and/or budding have important significance because they are the most conservative region along the virus sequence. Finding protein-membrane and protein–protein interaction inhibitors should be a good strategy against HCV infection as they might become in potential therapeutic agents. The structural proteins of HCV consist of the core protein, which forms the viral nucleocapsid, the envelope glycoproteins E1 and E2, both of them transmembrane proteins and the p7 protein. The HCV core protein is well conserved among the different HCV strains (Cha et al., 1992). This protein has many functions, although one of the most important is its implication in the budding process. We have analysed and identified regions 29-46, 57-74, 85-123 and 155-172 as the most membrane-active regions of the HCV core protein. Future studies of these regions could be important for understanding the molecular mechanism of viral budding as well as making possible the future development of HCV assembly inhibitors which may lead to new vaccine strategies. Protein p7 is essential for the efficient assembly and release of infectious virions indicating that p7 is primarily involved in the late phase of the virus replication cycle (Steinmann et al., 2007). We have reported the identification of a membranotropic region in p7 coincidental with the loop domain of this protein. One peptide from this domain forms pores whose size is comprised between 6 and 23 Å, which is a similar pore diameter that the pore formed by the native protein. Therefore this protein domain may be essential for the formation of the active ion channel. Accordingly, the p7 loop appears to be an attractive candidate for antiviral drug development leading to new vaccine strategiesThe HCV envelope glycoproteins E1 and E2 are truncated class II fusion proteins (Garry and Dash, 2003). To investigate the structural basis of HCV membrane fusion and identify new targets for searching new fusion inhibitors, we have carried out the analysis of the different regions of HCV E1 and E2 envelope glycoproteins which might interact with phospholipid membranes. After the location of the fusion domain we have made an in-depth biophysical characterization of their interaction with the membrane. We propose the region 603-634, one of the most E2 fusogenic region, to be implicated in the fusion process, affecting the structure of the membrane and helping in the fusion process to the fusion peptide in the disruption the membrane topology and destabilization the target membrane. We have proposed the segment encompassing residues 309-340 of the HCV E1 glycoprotein, another region implicated in the fusion process, in a similar way than the PreTM domain of class I fusion proteins (Guillen et al., 2007; Sainz et al., 2005; Suarez et al., 2000). The peptide binds to the membrane surface and modulates the phospholipid biophysical properties, is located in the membrane surface and perturbs significatively the bilayer architecture. We suggest that the E1 region where the E1PTM peptide is located might be a fusion determinant and probably has an essential role in the membrane fusion process. If that were true, it would imply that both HCV E1 and E2 glycoproteins are directly implicated in the mechanism that makes possible the entry of the HCV virus into its cellular host. We have located the fusion peptide of HCV in the region 274-298 in the E1 glycoprotein. We have observed that the peptide disturbs the membrane and it is inserted into the lipid bilayer interphase. The peptide showed, similarly to HCVpp, an increased fusogenic effect in the presence of cholesterol as well as it stabilised nonlamellar structures in the membrane. This region might be essential for the assistance and enhancement of the viral and cell fusion process. As a working hypothesis, if these membranotropic regions of the proteins would not interact with the membrane, the fusion process could not happen, and therefore the virus could not enter into the host cell. We have tried to prevent the interaction of these membranotropic regions with the membrane by using other peptides from the envelope glycoproteins which might interact between them. After several screenings, we have found two peptides directed against the fusion peptide region that reduced about 93% and 98% the leakage and hemifusion effect of the target. We have assayed in vivo the entry