Brain carboxylesterases interacting with organophosphorus compounds: Kinetic characterization and approaches to purification and molecular identification

Abstract

Organophosphorus compounds (OPs) are a large, diverse class of chemicals used for several purposes (pesticides, warfare agents, flame retardants, ectoparasiticides, investigation drugs, etc.). They induce several neurotoxic disorders: (i) acute cholinergic toxicity caused by covalent organophosphorylation of acetylcholinesterase; (ii) organophosphate‐induced delayed neuropathy (OPIDN) caused by the inhibition and subsequent aging of the membrane protein called neuropathy target esterase (NTE); (iii) chronic neurobehavioral and neuropsychological consequences have been associated with a low‐medium level of exposure to OP, which cannot be explained with known targets; (iv) potentiation of neuropathy, whose molecular target is not identified, is caused by some esterase inhibitors (potentiators) when they are administered following a low dose of neuropathic OPs . Potentially, many enzyme systems can interact with specific OPs. Most of the known targets of OPs have been found in the serine esterases family. Kinetic models have been developed and applied to detect OPs binding esterases in complex biological preparations. Here, some esterases have been detected using phenyl valerate as a substrate, and they have been kinetically discriminated with mipafox (OIPDN inducer), paraoxon (non inducer) and phenylmethyl sulfonyl fluoride (potentiator of OPIDN). The study was performed using soluble and membrane fractions of chicken brain, the animal model of OPIDN. The existence of at least seven esterase components with varying kinetic behaviors was deduced. Four are membranebound (EPAlfa, EPBeta, EPGamma and EPDelta) and three are cytosolic (EAlfa, EBeta and EGamma). One of them, EPGamma is attributed to the protein NTE given its kinetic properties. EPGamma is the only esterase component known for which toxicological and biological roles have been identified, and it is molecularly and genomically characterized. The role of the other six esterase components remains unknown, but they might contain one or various enzymes with similar kinetic properties. However their interactions with the inhibitors reveal that they can be related with Ops neurotoxicity. Components EAlfa and EPAlfa might play a role in toxicity and detoxication in the low‐level long‐term exposure of organophosphate compounds because they are highly sensitive and can be spontaneous reactivated after paraoxon inhibition. Components EBeta and EPBeta may play a role in OPIDN potentiation because they are sensitive to PMSF and resistant to mipafox. Moreover, preexposure to PMSF, paraoxon or mipafox at non inhibitory concentrations in components EAlfa and EGamma diminishes sensitivity to mipafox, PMSF or paraoxon, suggesting an irreversible modification of sites other than the catalytic center by inhibitors. These interactions may be relevant for interpreting the potentiation phenomenon and for understanding the neurotoxic effects of multiple exposures to xenobiotics. Thanks to this work, we have established appropriate criteria for prepare a protocol to simply test a routine analysis of all the phenyl valerate esterases components in chicken brain. A soluble chicken brain fraction was selected as raw material to separate toxicologically relevant target proteins. A fractionation method of the soluble esterase components was developed by multistep high‐performance semipreparative chromatography. The soluble chicken brain fraction was separated into three different fractions in size exclusion chromatography. Then ion exchange chromatography of all these fractions was applied. Enriched fractions with the enzymatic components of interest were obtained. Different chromatographic profiles were obtained when the same separation procedure was carried out with samples pretreated with mipafox, suggesting that treatment with mipafox modifies the ionic properties of a wide range of proteins. High specific activity was obtained for component EAlfa in one of the fractions. This fraction was chosen to do a preliminary protein identification test by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Indeed 259 proteins were identified in the sample according to the genomic chicken data, which demonstrates that the samples obtained in the fractionation procedure are appropriate for proteomic analysis. Using a bioinformatics approach, a cholinesterase precursor was found to be a potential target to bind to OPs as it is the only one of the 259 proteins that possesses the specific sequence for being potential serine esterase according to the genomic data. However, we cannot discard that any of the other proteins present in the sample could be responsible for the enzymatic activity. The molecular identification of the whole group of enzymes responsible for phenyl valerate esterase activity and the interaction with inhibitors is a long‐term objective of our laboratory, and the results of this work are useful for ongoing purification and molecular identification studies.

Los compuestos organofosforados (OPs) constituyen un amplio grupo de compuestos químicos utilizados con diversos fines (plaguicidas, agentes de guerra, retardantes de llama, ectoparasiticidas, medicamentos en investigación, etc.). Los OPs pueden causar varios efectos neurotóxicos: (i) la toxicidad colinérgica aguda debida a la organofosforilación de la enzima acetilcolinesterasa, (ii) la neuropatía retardada inducida por organofosforados (OPIDN) causada por la inhibición y posterior envejecimiento de la enzima esterasa diana de neuropatía (NTE), (iii) efectos neuroconductuales y neuropsicológicos crónicos se han asociado con una exposición a dosis medio‐bajas de OPs, que no se puede explicarse con las moléculas diana conocidas; ( iv) la potenciación de OPIDN , cuya molécula diana se desconoce. Potencialmente, muchos sistemas enzimáticos podrían interaccionar con los OPs. La mayoría de las moléculas diana de los OPs se han encontrado en la familia de enzimas serina esterasas. Recientemente se han desarrollado los modelos cinéticos que permiten la detección de esterasas que se unen a OPs en preparaciones biológicas complejas donde se dan distintas reacciones concomitantemente y hay varios sistemas enzimáticos. En este trabajo, se han detectado las esterasas de cerebro de pollo (de las fracciones solubles y de membrana) que hidrolizan fenilvalerato esterasa. Éstas se han discriminado cinéticamente con los inhibidores mipafox (inductor de OPIDN), paraoxon (no inductor) y PMSF (potenciador de OPIDN). Se han caracterizado siete componentes esterásicos con diferentes comportamientos cinéticos. Cuatro son de mebrana (EPAlfa , EPBeta, EPGamma y EPDelta) y tres son citosólicos (EAlfa, EBeta y EGamma). EPGamma se atribuye a la enzima NTE dado sus propiedades cinéticas, éste es el único componente detectado para el cual se han identificado roles toxicológicos y biológicos, y esta molecularmente y genómicamente caracterizado. El papel toxicológico y biológico de los otros seis componentes se desconoce, además cada uno podría estar formado por una o varias enzimas con propiedades similares. Sin embargo, las interacciones observadas con los inhibidores revelan que puedan estar relacionados con la neurotoxicidad de OPs. Los componentes EAlfa y EPAlfa podrían desempeñar un papel en la toxicidad a bajas dosis y largo plazo de OPs, debido a su alta sensibilidad y a que pueden ser espontáneamente reactivados después de la inhibición con paraoxon. Los componentes EBeta y EPBeta podrían jugar un papel en la potenciación de OPIDN ya que son sensibles a PMSF y resistentes a mipafox. Además se ha observado en los componentes EAlfa y EGamma que la exposición a concentraciones no inhibitorias a los inhibidores disminuye la sensibilidad al mipafox, PMSF o paraoxon. Esto sugiere una modificación irreversible de los inhibidores en otro sitio de unión al del sustrato. Estas interacciones podrían ser pertinentes para interpretar fenómenos de potenciación y en la comprensión de los efectos neurotóxicos de exposiciones a múltiples xenobióticos. Gracias a esta discriminación cinética se ha establecido un ensayo sencillo que permite la discriminación de todos los componentes enzimáticos. Se ha desarrollado un método de semifraccionamiento de los componentes esterásicos en la fracción soluble de cerebro mediante varias etapas en cromatografía preparativa de alta resolución. Mediante el cual la fracción soluble de cerebro de pollo se separó en tres fracciones diferentes por cromatografía de exclusión molecular. Cada una de estas fracciones se separo posteriormente en más de cinco por cromatografía de intercambio aniónico se obtuvieron fracciones enriquecidas con los componentes enzimáticos de interés toxicológico. Cuando el mismo procedimiento de semifraccionamiento se llevó a cabo con muestras pretratadas con mipafox se obtuvieron perfiles cromatográficos diferentes, sugiriendo que el tratamiento con mipafox modifica las propiedades iónicas de un amplio número de proteínas. Se obtuvo una alta actividad específica para el componente EAlfa en una de las fracciones, en la que se realizó un ensayo preliminar de identificación de proteínas por espectrometría de masas. Se identificaron 259 proteínas en la muestra de acuerdo con los datos genómicos, demostrando que las muestras obtenidas en el procedimiento de fraccionamiento son apropiadas para el análisis proteómico. Mediante un análisis bioinformático de la lista de proteínas se encontró la enzima butirilcolinesterasa como potencial diana de los efectos cinéticos observados en esa fracción, ya que es la única de las 259 proteínas que posee potencial actividad esterásica. Sin embargo no puede descartarse que cualquiera del resto de proteínas presentes en la muestra pudiera ser responsable de la actividad enzimática. La identificación molecular de todo este grupo de enzimas responsables de la actividad fenilvalerato esterasa y de la interacción con los inhibidores es un objetivo a largo plazo de nuestro laboratorio y estos resultados están siendo aplicados en actuales estudios de purificación e identificación molecular.