Identificación de marcadores de respuesta y papel de la autofagia en la resistencia al tratamiento con Selumetinib (AZD6244) en lineas celulares de carcinoma colorrectal

Abstract

AZD6244 (Selumetinib, ARRY-142886) es un inhibidor de MEK1/2 que ha ganado interés en los últimos tiempos como agente antitumoral. Los principales objetivos de este trabajo de tesis doctoral han consistido en la identificación de marcadores de respuesta y en la evaluación del papel de la autofagia en la resistencia al tratamiento con AZD6244. A través de ensayos de proliferación, hemos clasificado las diferentes líneas celulares en sensibles y resistentes en función de sus valores de IC50. De forma interesante, AZD6244 es capaz de inhibir la fosforilación de p70S6K y de su proteína diana efectora, RPS6, en las líneas celulares sensibles. Sin embargo, en las células resistentes, los niveles de fosforilación de estas proteínas permanecen inalterados o incluso aumentan en respuesta al tratamiento con AZD6244. Además, las células resistentes presentan niveles basales de fosforilación de p70S6K y RPS6 muy elevados, comparado con las células sensibles en las que los niveles basales de fosforilacion de estas proteínas son mínimos. La inhibición farmacológica de p70S6K y RPS6 utilizando NVP-BEZ235 (un inhibidor dual de PI3K y mTOR) y PF-4708671 (un inhibidor específico de p70S6K) potencia el efecto de AZD6244 en las células resistentes. Como conclusión, p70S6K y su diana efectora RPS6 podrían actuar como biomarcadores de respuesta potenciales de la resistencia a AZD6244 en cáncer colorrectal. La segunda parte de este trabajo ha tenido como objetivo examinar el papel de la autofagia en la capacidad de AZD6244 para inducir muerte celular. Con esta finalidad, hemos empleado moduladores de autofagia tales como Bafilomicina A1 (BAF), Cloroquina (CQ), 3-Metiladenina (3-MA) y Rapamicina (RAPA). Curiosamente, AZD6244 induce muerte celular acompañada de autofagia en las células sensibles a AZD6244. Además, los inhibidores autofágicos BAF, 3-MA y CQ potencian la muerte celular inducida por AZD6244. Sin embargo, cuando AZD6244 es utilizado en combinación con el inductor autofágico RAPA, se observa una mayor supervivencia de las células. En el caso de las células resistentes, la autofagia no parece desempeñar un papel en su resistencia. En conjunto, estos resultados sugieren que la autofagia estaría actuando como mecanismo protector en las células sensibles a AZD6244, con lo cual la combinación de inhibidores de autofagia con AZD6244 podría constituir una estrategia terapéutica interesante en los tratamientos de los pacientes con cáncer de colon y recto.

AZD6244 (Selumetinib, ARRY-142886) is a MEK1/2 inhibitor that has gained interest as an anti-tumour agent. The main aims of this doctoral study were to identify response markers and to evaluate the role of autophagy in mediating resistance to AZD6244. By using proliferation assays, we have classified the cells in AZD6244-sensitive and AZD6244-resistant according to their IC50 value. Interestingly, AZD6244 inhibits phosphorylation of p70S6K and its main target, RPS6 in sensitive cell lines, whereas in resistant cells p70S6K and RPS6 phosphorylation is unaffected or even increase. Also, AZD6244-resistant cells show increased basal levels of p70S6K phosphorylation, whereas phosphorylation basal levels of this protein are minimal in AZD6244-sensitive cells. In fact, pharmacological inhibition of p70S6K and RPS6 by NVP-BEZ235 (a dual inhibitor of PI3K and mTOR) or PF-4708671 (a specific p70S6K inhibitor) potentiate AZD6244 effects in resistant cell lines. In conclusion, p70S6K and its main target RPS6 could act as potencial biomarkers of response to AZD6244 treatment in colorectal cancer. The second part of this study aimed to examine the role of autophagy in the ability of AZD6244 to induce cell death. For this purpose, autophagy modulators such as Bafilomycin A1 (BAF), Chloroquine (CQ), 3-Metiladenine (3-MA) and Rapamycin (RAPA) have been used. Interestingly, AZD6244 induces both cell death and autophagy in AZD6244-sensitive cells. Moreover, BAF, 3-MA and CQ potentiate AZD6244-induced cell death. However, when AZD6244 is combined with the autophagy inducer, RAPA, an increase in cell survival is observed. In contrast, autophagy does not seem to have a role in mediating resistance in AZD6244-resistant cells. Altogether, these results suggest that autophagy could act as a survival mechanism in cell lines sensitive to AZD6244. Thus, autophagy inhibitors in combination with AZD6244 may be an interesting therapeutic strategy to treat colorectal cancer.