FIGURA 6. Silenciamiento dirigido en células corticotropas murinas AtT-20.

(A) Silenciamiento de Nr3c1 y tratamiento con dexametasona. Células AtT-20 transfectadas con siRNA control (siControl) o siRNA dirigido frente a Nr3c1 (siNR3C1) fueron tratadas posteriormente con vehículo (DMSO) o dexametasona (DEX, 100 nM) durante 24 h. La expresión relativa de Nr3c1 se determinó mediante RT-qPCR, normalizada a Eef2 y expresada mediante 2^−ΔΔCt tomando siControl + DMSO como calibrador. El siRNA dirigido a Nr3c1 no produjo la reducción esperada del transcrito, por lo que el experimento no permite establecer una relación causal entre la pérdida de NR3C1 y la respuesta a dexametasona.

(B) Silenciamiento de Pcsk1 y estimulación con CRH. Células AtT-20 transfectadas con siControl o siRNA dirigido frente a Pcsk1 (siPCSK1) fueron cultivadas en ausencia o presencia de CRH (10 nM) durante 24 h. La expresión relativa de Pcsk1 se determinó mediante RT-qPCR, normalizada a Eef2 y expresada mediante 2^−ΔΔCt tomando siControl sin CRH como calibrador. El silenciamiento de Pcsk1 fue eficaz a nivel transcripcional: la expresión se redujo aproximadamente al 17 % del control sin CRH y al 11 % del control con CRH.

Los gráficos representan media ± SEM de tres experimentos biológicos independientes. Los análisis se realizaron sobre valores ΔCt mediante modelos lineales factoriales, incluyendo el tratamiento farmacológico, el siRNA, su interacción y el experimento biológico como factor de bloqueo; las comparaciones planificadas se ajustaron mediante el método de Holm. ns, no significativo; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ****P<0,0001.