The cold-activated TRPM8 channel: agonism by macrolide immunosuppressants and modulation by Gq protein-coupled receptors signaling pathways

Abstract

TRPM8 is a polymodal, non-selective cation channel activated by cold temperature and cooling compounds (i.e. menthol) which is mainly expressed in a small subpopulation of cold-sensitive peripheral sensory neurons. TRPM8 is the principal physiological sensor of environmental cold temperatures and is also involved in different pathophysiological conditions such as cold allodynia or dye eye disease. At the same time, activation of TRPM8-expressing fibers, for example by cold or menthol, has analgesic and antipruritic effects. The dual role of TRPM8 in pain transmission has led to a strong interest in the pursuit of novel modulators of TRPM8 channels. In this thesis, different aspects of TRPM8 channel modulation have been studied. First, I show that TRPM8 is a pharmacological target of two natural macrolide molecules; tacrolimus (FK506), a calcineurin inhibitor, and rapamycin (Sirolimus), an mTOR inhibitor. These two molecules share immunosuppressant properties and are widely used in the clinic, mainly for the treatment of organ rejection following transplants. Additionally, tacrolimus is also used in topical formulations for the treatment of atopic dermatitis and dry eye disease, and its use is often accompanied by adverse sensory side effects such as burning pain. I demonstrate by calcium imaging and patch clamp experiments that tacrolimus and rapamycin activate heterologously expressed TRPM8 channels in different species, including humans, and sensitize their response to cold temperatures by inducing a leftward shift in the voltage-dependent activation curve. The effect of tacrolimus on TRPM8 channels is direct and independent of the already known binding sites for other TRPM8 agonists (e.g. menthol or icilin). In cultured mouse DRG neurons, tacrolimus and rapamycin activate almost exclusively TRPM8-expressing cold-sensitive neurons, and these responses were drastically blunted in TRPM8 KO mice or after the application of TRPM8 antagonists. Patch-clamp recordings of cold-sensitive neurons confirm that both compounds activate inward currents and strongly potentiate the inward current evoked by cold. Behavioral experiments demonstrated that tacrolimus triggers eye blinking although this effect remains in TRPM8 KO mice, suggesting additional molecular targets. Second, the mechanisms involved in TRPM8 modulation by Gq Protein-Coupled Receptors (GqPCR) have been studied. This modulation could be important in the context of inflammation, considering that some GqPCRs for pro-inflammatory mediators (e.g. bradykinin type 2 or histamine H1 receptors) can modulate the excitability of peripheral sensory nerve terminals. TRPM8 channels are inhibited by GqPCRs activation; however, the molecular mechanisms underlying TRPM8 modulation remain unclear. Some studies support the modulation through the canonical signaling pathway, involving PLC activation and reduction in PI(4,5)P2 levels or PKC-mediated phosphorylation of the channel, while others point to a direct interaction of TRPM8 with the Gαq subunit. I studied the GqPCR-mediated inhibition of TRPM8 in heterologous expression systems and the mechanisms underlying this effect. Activation of GqPCRs modulates TRPM8 menthol- and cold-evoked currents in a fast and reversible manner, an effect that is dependent on temperature and voltage. By different strategies I confirmed that PI(4,5)P2 depletion is necessary for TRPM8 modulation by GqPCR. The selective depletion of PI(4,5)P2 by activation of a voltage sensitive lipid 5 phosphatase (Dr-VSP) is enough to recapitulate the effect of GqPCR activation on TRPM8 inward currents. Moreover, I demonstrated that PI(4,5)P2 hydrolysis shows precise temporal correlation with TRPM8 current inhibition in simultaneous patch-clamp and fluorescence-based PI(4,5)P2 level measurements. Importantly, pharmacological blockade of PLC and therefore PI(4,5)P2 hydrolysis prevents the inhibitory effect of GqPCRs activation on TRPM8 channels. In DRG cold-sensitive neurons, cold-evoked responses were not significantly affected by activation of GqPCRs. Altogether, these results identify TRPM8 channels in sensory neurons as molecular targets of the immunosuppressants tacrolimus and rapamycin, two clinically approved drugs. In addition, these findings contribute to the characterization of TRPM8 modulation by GqPCRs, and demonstrate that PLC-mediated PI(4,5)P2 depletion is a necessary event and underlies TRPM8 inhibition evoked by GqPCR activation.

TRPM8 es un canal catiónico no selectivo, polimodal, activado por bajas temperaturas y compuestos refrescantes (p.e. mentol) y que se expresa principalmente en una pequeña subpoblación de neuronas sensoriales periféricas sensibles al frio. TRPM8 es el principal sensor de frio ambiental y también participa en diferentes patologías como la alodinia al frio o en la enfermedad del ojo seco. A su vez, la activación de las fibras que expresan TRPM8, por ejemplo, por frio o mentol, tiene efectos analgésicos y antipruríticos. El papel dual de TRPM8 en la transmisión del dolor ha promovido el interés en la búsqueda de nuevos moduladores específicos de este canal. En esta tesis he estudiado diferentes aspectos de la modulación del canal TRPM8. En primer lugar, demuestro que TRPM8 es una diana farmacológica de dos macrólidos naturales: tacrolimus (FK506), un inhibidor de la calcineurina, y rapamicina (Sirolimus), un inhibidor de mTOR. Estas dos moléculas comparten propiedades inmunosupresoras y son ampliamente utilizadas en la clínica, principalmente para el tratamiento del rechazo de órganos después de trasplantes. Además, tacrolimus también se utiliza en formulaciones de uso tópico para el tratamiento de la dermatitis atópica o para la enfermedad del ojo seco, y su uso va acompañado frecuentemente de efectos secundarios sensoriales adversos, como por ejemplo quemazón en la piel. Aquí demuestro, mediante técnicas de imagen de calcio y electrofisiología, que tacrolimus y rapamicina activan canales TRPM8 de diferentes especies, incluyendo humanos, expresados en sistemas heterólogos, y sensibilizan su respuesta al frio, induciendo un desplazamiento en la curva de voltaje-dependencia hacia la izquierda. El efecto de tacrolimus sobre los canales TRPM8 es directo e independiente de los sitios de unión conocidos hasta ahora para el resto de agonistas de TRPM8 (p.e. mentol o icilina). En neuronas sensoriales en cultivo, provenientes de los ganglios raquídeos, tacrolimus y rapamicina activan casi exclusivamente neuronas sensibles a frio que expresan el canal iónico TRPM8. Además, estas respuestas prácticamente desaparecen en presencia de antagonistas de TRPM8 o en ratones TRPM8 knockout. Registros electrofisiológicos de patch-clamp en neuronas sensibles a frio confirmaron que ambos compuestos activan una corriente de entrada, y a su vez, potencian fuertemente la corriente de entrada generada por el descenso de la temperatura. Experimentos de comportamiento demostraron que tacrolimus aumenta el parpadeo, aunque este efecto permanece en ratones TRPM8 knockout, sugiriendo otras dianas moleculares adicionales. En segundo lugar, estudié los mecanismos que participan en la modulación de TRPM8 por receptores acoplados a proteínas Gq (RAPGq). Esta modulación podría ser relevante en el contexto de una situación de inflamación, debido a que diversos mediadores pro-inflamatorios que activan RAPGq (p.e. receptores de bradiquinina tipo 2 o receptores H1 de histamina) pueden modular la excitabilidad de las terminaciones nerviosas periféricas. Los canales TRPM8 se inhiben por la activación de RAPGq. Sin embargo, el mecanismo molecular que media este efecto no está definido. Algunos estudios proponen la modulación de TRPM8 a través de la ruta de señalización canónica de los RAPGq, que incluye la activación de la fosfolipasa C (PLC) y la reducción de los niveles de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI(4,5)P2) o la fosforilación del canal mediada por la protein kinasa C, mientras que otros grupos defienden la interacción directa de la subunidad Gαq con el canal. En este trabajo estudié la inhibición de TRPM8 mediada por RAPGq en sistemas de expresión heterólogos y los mecanismos subyacentes a esta modulación. La activación de RAPGq modula las corrientes evocadas por mentol y frio de una manera rápida y reversible, un efecto que es dependiente de la temperatura y el voltaje. Mediante diferentes estrategias confirmé que la eliminación de PI(4,5)P2 es necesaria para la modulación de TRPM8 por RAPGq. La eliminación selectiva de PI(4,5)P2 por una fosfatasa activada por voltaje (Dr-VSP) es suficiente para recapitular el efecto de la activación de RAPGq sobre la corriente de entrada de TRPM8. Además, mediante experimentos simultáneos de registro electrofisiológico de las corrientes TRPM8 y la imagen de un sensor fluorescente de PI(4,5)P2, demostré que la hidrólisis de PI(4,5)P2 y la inhibición de las corrientes TRPM8 siguen un curso temporal idéntico. El bloqueo farmacológico de la PLC y por tanto de la reducción de los niveles de PI(4,5)P2, elimina el efecto de la activación de RAPGq sobre los canales TRPM8. En neuronas sensoriales activadas por frio, la respuesta se vio modestamente afectada por la activación de RAPGq. En resumen, mis resultados identifican el canal TRPM8 en neuronas sensoriales como una diana molecular de los inmunosupresores tacrolimus y rapamicina, dos fármacos aprobados clínicamente. Además, este estudio contribuye a la caracterización de la modulación de TRPM8 por RAPGq, demostrando que la eliminación de PI(4,5)P2 mediada por PLC es un evento necesario y que subyace a la inhibición de TRPM8 por la activación de RAPGq.