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Optimización del ensayo de embriotoxicidad con células madre de ratón mediante el uso de genes biomarcadores de diferenciación celular


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Title:
Optimización del ensayo de embriotoxicidad con células madre de ratón mediante el uso de genes biomarcadores de diferenciación celular
Authors:
Romero Lucena, Andrea Carolina
Tutor:
Sogorb Sánchez, Miguel Ángel
Vilanova Gisbert, Eugenio
Department:
Instituto de Bioingeniería
Issue Date:
2017-07-07
Abstract:
La prueba de las células madre embrionarias (EST, por Embryonic Stem cell Test) es el único método de ensayo embriotoxicidad validado que suprime totalmente la utilización de animales de experimentación. El ensayo EST emplea dos diferentes líneas celulares, las células madre embrionarias de ratón D3 (como modelo de célula en diferenciación) y los fibroblastos de ratón 3T3 (como modelo de células no diferenciantes). En el ensayo EST validado tras 10 días de exposición de fibroblastos cultivados en monocapa se ha de determinar la concentración de agente potencialmente embriotóxico capaz de inducir una disminución de viabilidad del 50% (IC503T3). Igualmente se determina el IC50D3 como la concentración de agente potencialmente embriotóxico capaz de inducir una disminución de viabilidad del 50% en células D3 cultivadas en monocapa expuestas durante 10 días. También se ha estimar la concentración de agente tóxico capaz de inhibir un 50% la diferenciación de cuerpos embrionarios de células D3 cultivados con la técnica de la gota colgante en cardiomiocitos latientes (ID50). Finalmente, unas funciones matemáticas de discriminación basadas en estos tres parámetros permiten asignar una clasificación al potencial embriotóxico del compuesto evaluado, que puede ser embriotóxico fuerte, débil o no embriotóxico.El European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL-ECVAM) decidió que el EST era un método científicamente válido y validado, pero que era necesario implementar mejoras en la cuantificación de las alteraciones de la diferenciación (preferiblemente a través de determinaciones cuantitativas de tipo molecular) antes de poder ser utilizado con finalidades reguladoras. Esta Tesis Doctoral estudia la implementación de posibles mejoras en el EST en línea con lo requerido por EURL-ECVAM introduciendo la cuantificación de la expresión génica como criterio de monitorización de alteraciones en la diferenciación (lo que además supone un valor añadido al permitir estudiar mecanismos moleculares de embriotoxicidad), reduciendo la duración total de la exposición a 5 días y simplificando la metodología empleando solamente cultivos de células D3 y 3T3 en monocapa.Se determinó la IC50D3 y la IC503T3 de células expuestas en monocapa durante 5 días a 7 diferentes compuestos modelo empleados en la validación del EST convencional (2 embriotóxicos fuertes, 3 embriotóxicos débiles y 2 no embriotóxicos). También se determinó para estos siete compuestos lo que denominamos CE50 o CE200, que se definen como las concentraciones del compuesto evaluado capaces de, bien reducir o bien aumentar la expresión un 50 o un 200%, respectivamente, de un total de 16 genes entre los cuáles se encontraban biomarcadores de formación de mesodermo (Mesp1, Vegfa, Myo1e y Hdac7), de ectodermo (Nrcam, Nes, Shh y Pnpla6) y de endodermo (Flk1 y Afp); así como también de procesos básicos para la supervivencia celular (Cdk1, Myc, Jun, Mixl1, Cer1 y Wnt3).Finalmente, se aplicaron las funciones matemáticas de discriminación del EST convencional utilizando los IC50D3 y IC503T3 calculados y sustituyendo el parámetro ID50 bien por CE50 o bien por CE200 (dependiendo de si el compuesto evaluado inducía una sobreexpresión o una represión de cada gen). Esto produjo para cada compuesto evaluado un conjunto de 16 diferentes predicciones de potencial embriotóxico (una por cada uno de los 16 genes empleados) y se consideró como predicción global final aquella categoría de embriotóxico para la que se hubiera obtenido un mayor número de predicciones individuales. Esta metodología obtuvo un 100% de predicciones correctas para los 7 compuestos modelo evaluados, lo cual es una mejora muy prometedora con respecto a los resultados del EST convencional validado, especialmente en lo relativo a la discriminación entre agentes embriotóxicos débiles y no embriotóxicos. Además la estrategia de evaluación propuesta aporta una aproximación mecanicista para comprender las alteraciones en la diferenciación celular y en el desarrollo embrionario inducidas por exposición a sustancias químicas, lo que dotará de una mayor robustez a los procesos de evaluación del riesgo de embriotoxicidad.Las mejoras implementadas en el método EST lo acercan a una futura utilización, probablemente en combinación con otras metodologías alternativas a la experimentación animal, con finalidades reguladoras y en procesos de cribado y detección de embriotoxicidad en ensayos masivos con librerías de compuestos.
Keywords/Subjects:
Biología molecular
Biología celular
Type of document:
application/pdf
Access rights:
info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:
Tesis doctorales - Ciencias e Ingenierías



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