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Regulación del reciclaje del ribosoma citoplásmico por el gen ABCE2 de Arabidopsis


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Title:
Regulación del reciclaje del ribosoma citoplásmico por el gen ABCE2 de Arabidopsis
Authors:
Navarro Quiles, Carla
Tutor:
Micol Molina, José Luis
Univerity:
Universidad Miguel Hernández de Elche
Department:
Departamentos de la UMH::Biología Aplicada
Issue Date:
2021-07-27
Abstract:
La mayoría de los genes que codifican proteínas implicadas en la traducción en Arabidopsis thaliana (en adelante, Arabidopsis) tienen parálogos cercanos. Sus alelos nulos son viables y causan un fenotipo morfológico débil pero distinguible del silvestre: generan hojas apuntadas e indentadas, con un patrón de venación aberrante, rasgo que se ha atribuido tradicionalmente a la perturbación de la homeostasis de la auxina. Las secuencias de las proteínas ATP-Binding Cassette E (ABCE) están conservadas entre las arqueas y los eucariotas. Se ha demostrado en la arquea Saccharolobus solfataricus, la levadura Saccharomyces cerevisiae y la especie humana que las ABCE son esenciales para el reciclaje de los ribosomas citoplásmicos. En estas tres especies distintas y distantes, una proteína ABCE separa las dos subunidades del ribosoma tras la terminación de la traducción, y acompaña a la subunidad 30S/40S hasta la iniciación de un nuevo ciclo de síntesis de proteínas. No se ha obtenido evidencia experimental alguna de la implicación de una ABCE en la traducción en el reino vegetal. En casi todos los genomas estudiados el gen ABCE es de copia única y solo los de algunos insectos, peces y plantas, como Arabidopsis, contienen dos, usualmente denominados ABCE1 y ABCE2. En esta Tesis hemos estudiado el mutante apiculata7-1 (api7- 1) de Arabidopsis, que fue aislado en el laboratorio de J.L. Micol y es portador de un alelo puntual, hipomorfo, recesivo y viable del gen ABCE2. El fenotipo morfológico de api7-1 es similar al causado por los alelos nulos viables de genes que codifican componentes de la maquinaria de la traducción. También hemos estudiado api7-2, un alelo insercional y letal recesivo de ABCE2. Hemos caracterizado los fenotipos morfológico, histológico y molecular de api7-1, prestando especial atención al patrón de venación de sus órganos planos, concluyendo que está muy alterado en las hojas del primer nudo de la roseta, pero no tanto en los cotiledones, las hojas del tercer nudo y las caulinares, y que es silvestre en los sépalos y los pétalos. Dado que la biosíntesis, el transporte polar y la señalización de la auxina contribuyen a la formación del patrón de venación foliar, hemos obtenido plantas api7-1 PIN1pro:PIN1:GFP, portadoras de una fusión traduccional de los genes que codifican el exportador de la auxina PIN-FORMED 1 (PIN1) y la proteína fluorescente verde (GFP), y api7-1 DR5pro:3XVENUS:N7, portadoras de un transgén testigo de la señalización de la auxina. El estudio mediante microscopía confocal de las raíces de estas plantas transgénicas indicó que el transporte de la auxina está disminuido, y su percepción, incrementada. Hemos realizado un análisis global del transcriptoma de api7-1, concluyendo que los genes que codifican las enzimas de la ruta principal de la biosíntesis de la auxina están desreprimidos. Nuestros resultados sugieren que una de las causas de las aberraciones de la venación foliar de api7-1 es el exceso de auxina. La ABCE2 de Arabidopsis contiene dos grupos hierro-azufre (FeS). Hemos constatado que los genes de respuesta a los déficits de hierro y azufre están desreprimidos en api7-1, posiblemente para compensar la insuficiencia de función de la ABCE2 mutante. El aumento de la concentración intracelular de hierro podría conllevar el de las especies reactivas de oxígeno, tal como sugiere la desrepresión de genes de respuesta a estrés oxidativo, que también se constata en nuestro análisis transcriptómico de api7-1. Hemos obtenido un transgén ABCE2pro:ABCE2:YFP, que restablece el fenotipo silvestre en el mutante api7-1. Hemos demostrado, en un ensayo de coinmunoprecipitación, que la proteína de fusión ABCE2:YFP interacciona con varios componentes de la maquinaria de la traducción. Uno de ellos es EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 3J (eIF3j), cuyo papel como proteína accesoria de las ABCE durante el reciclaje de los ribosomas se ha demostrado en células de Saccharomyces cerevisiae y humanas. Esta observación sugiere que la ABCE2 de Arabidopsis —y por extensión, sus ortólogas vegetales— participa en el reciclaje del ribosoma citoplásmico. Las regiones no traducidas 5′ (5′ UTR, de 5′ untranslated region) y 3′ UTR de los ARNm eucarióticos contienen secuencias que regulan postranscripcionalmente la expresión génica. La insuficiencia de la función de la ABCE1 de Saccharomyces cerevisiae y células humanas dificulta la disociación de los ribosomas, y propicia que se internen en la 3′ UTR, desplazando a su paso a los factores reguladores unidos a esta última, prolongando o acortando la vida media del ARNm. El mutante api7-1 es un buen candidato para establecer si este fenómeno también ocurre en las plantas; de ser así, se obtendría por esta vía una confirmación adicional de que la ABCE2 de Arabidopsis participa en el reciclaje del ribosoma. Hemos constatado que varias brasicáceas presentan dos genes ABCE. Nuestro análisis filogenético indica que la duplicación del correspondiente gen ancestral se produjo en las rósidas antes de la diversificación de las brasicáceas y sugiere que los genes ABCE1 de las brasicáceas están sujetos a una menor presión selectiva que sus parálogos ABCE2. El transgén ABCE2pro:ABCE1 —pero no el ABCE1pro:ABCE2— restablece parciamente el fenotipo silvestre en las plantas api7-1. ABCE1 se expresa muy poco en Arabidopsis, siendo el órgano en que se detecta su mayor nivel la flor, cuya morfología es aparentemente silvestre en el mutante api7-1. Estas observaciones sugieren que las proteínas codificadas por los genes ABCE1 y ABCE2, pero no sus promotores, son funcionalmente redundantes. ABCE2 parece conservar su función ancestral, mientras que ABCE1 está en vías de subfuncionalización o pseudogenización.
Most of the genes that encode proteins involved in translation in Arabidopsis thaliana (hereafter referred to as Arabidopsis) have close paralogs. Their null alleles are viable and cause a morphological phenotype that is mild but distinguishable from the wild type: they produce pointed and dentate leaves, with an aberrant venation pattern usually ascribed to a perturbed auxin homeostasis. The sequences of ATP-Binding Cassette E (ABCE) proteins are conserved among archaea and eukaryotes. It has been shown in the archaeon Saccharolobus solfataricus, the yeast Saccharomyces cerevisiae and humans, that ABCEs are essential for cytoplasmic ribosome recycling. In these three distinct and distant species, an ABCE protein dissociates the two ribosomal subunits after translation termination, and escorts the 30S/40S subunit to the initiation of a new cycle of protein synthesis. There is no experimental evidence of the involvement in translation of any ABCE from the plant kingdom. In almost all studied genomes, ABCE is a single-copy gene, and only those from some insects, fishes and plants, like Arabidopsis, contain two, usually named ABCE1 and ABCE2. In this Thesis, we studied the Arabidopsis apiculata7-1 (api7-1) mutant, which was isolated in the laboratory of J.L. Micol, and carries a viable, recessive and hypomorphic allele of ABCE2. The morphological phenotype of api7-1 is similar to those caused by viable null alleles of genes encoding components of the translation machinery. We also studied api7-2, an insertional, recessive lethal allele of ABCE2. We characterized the morphological, histological and molecular phenotypes of api7-1, paying special attention to the venation pattern of its flat organs, concluding that it is severely perturbed in first-node rosette leaves, at a lesser extent in cotyledons, and third-node and cauline leaves, and wild-type in sepals and petals. Given that auxin biosynthesis, polar transport and signaling contribute to leaf venation patterning, we obtained api7-1 PIN1pro:PIN1:GFP plants, which carry a translational fusion of the genes encoding the auxin efflux carrier PIN-FORMED 1 (PIN1) and the green fluorescent protein (GFP). We also obtained api7-1 DR5pro:3XVENUS:N7 plants, which carry a reporter transgene of auxin signaling. The study of the roots of these transgenic plants using confocal microscopy indicated that auxin transport and perception are decreased and increased, respectively. We performed an RNA-seq analysis of the api7-1 transcriptome, concluding that the genes that encode enzymes involved in the main auxin biosynthesis pathway are upregulated. Our results suggest that an overproduction of auxin is partially responsible of the aberrations observed in the venation of api7-1 leaves. Arabidopsis ABCE2 contains two iron-sulfur (FeS) clusters. We observed that genes involved in the response to iron and sulfur starvation are upregulated in api7-1, possibly to compensate for the loss of function of the mutant ABCE2 protein. The increase in intracellular iron content might induce that of reactive oxygen species, as suggested by the upregulation of genes involved in the response to oxidative stress that we also observed in our RNA-seq of api7-1. We obtained an ABCE2pro:ABCE2:YFP transgene that restores the wild-type phenotype in the api7-1 mutant. In a co-immunoprecipitation assay, we found that the ABCE2:YFP fusion protein interacts with several components of the translation machinery. One of these is EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 3J (eIF3j), whose role in ribosome recycling as an ABCE accessory factor has been described in Saccharomyces cerevisiae and human cells. This observation suggests that the Arabidopsis ABCE2 protein and, by extension, all its plant orthologs, participate in ribosome recycling. The 5′ untranslated region (5′ UTR) and 3′ UTR of eukaryotic mRNAs contain sequences for the post-transcriptional regulation of gene expression. In Saccharomyces cerevisiae and human cells, ABCE1 loss of function hinders ribosome dissociation, and allows ribosomes to enter the 3′ UTR. In turn, the passage of the ribosomes through the 3′ UTR displaces the regulatory elements bound to that region, increasing or decreasing mRNA lifespan. The api7-1 mutant is a suitable candidate to ascertain whether this process also occurs in plants; in that case, this would corroborate the involvement of Arabidopsis ABCE2 in ribosome recycling. We found that several Brassicaceae species contain two ABCE genes. Our phylogenetic analysis indicates that the duplication of the ancestral gene occurred in Rosidae before the divergence of the Brassicaceae family. In addition, we determined that the ABCE1 genes are under a lower evolutionary pressure than their ABCE2 paralogs. The ABCE2pro:ABCE1 transgene, but not ABCE1pro:ABCE2, partially restores the wild-type phenotype in api7-1 plants. ABCE1 expression is very low in Arabidopsis, with a maximum at the flower, whose morphological phenotype is indistinguishable from wild type in the api7-1 mutant. These observations suggest that the proteins encoded by the ABCE1 and ABCE2 genes, but not their promoters, are functionally redundant. ABCE2 seems to conserve its ancestral function, while ABCE1 is undergoing subfunctionalization or pseudogenization.
Keywords/Subjects:
Genética molecular de plantas
Desarrollo vegetal
Genética vegetal
Biología vegetal de plantas
Type of document:
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Tesis doctorales - Ciencias e Ingenierías



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