Abstract:
Esta tesis se enfoca en el diseño asistido por ordenador de dos enzimas, la
endonucleasa de Inclusión Nuclear a (NIa) del virus del grabado del tabaco (proteasa
TEV) y una endonucleasa llamada meganucleasa I-CreI, descubierta en el alga verde
unicelular Chlamydomonas reinhardtii. Para este propósito se ha usado FoldX, un
algoritmo de diseño de proteínas desarrollado en nuestro laboratorio, que está basado en
parámetros físicos y datos empíricos, y que utiliza la información estructural de la
proteína para llevar a cabo las mutaciones y los cálculos teóricos de sus energías.La proteasa TEV reconoce y corta específicamente una secuencia canónica de
aminoácidos, y es comúnmente usada como herramienta molecular en diferentes técnicas
entre las que destaca la purificación de proteínas recombinantes. Nuestro objetivo se
enfocó en el cambio del sitio de reconocimiento de la proteasa TEV, para intentar
dirigirla contra otras secuencias de interés específicas, y así incrementar su aplicabilidad.Por otra parte, las meganucleasas forman dímeros que reconocen y cortan
específicamente largas secuencias dianas en el ADN. Los monómeros de la enzima
I-CreI, se rediseñaron para impedir la formación de homodímeros y permitir solamente la
formación de heterodímeros obligados. De este modo, se incrementa enormemente el
repertorio de dianas únicas no-palindrómicas reconocidas en el genoma. Estas nuevas
enzimas pueden ser usadas en un amplio rango de aplicaciones, incluyendo la corrección
de mutaciones responsables de enfermedades hereditarias monogénicas.Por tanto, con este trabajo se demuestra que el diseño computacional de proteínas
es una herramienta joven, aunque eficaz para rediseñar enzimas “a la carta”. Igualmente,
el continuo desarrollo de la investigación y los conocimientos de estructura de proteínas,
permitirá a este campo seguir evolucionando durante los próximos años.
This dissertation focuses on the design of two enzymes, the Tobacco Etch Virus
“Nuclear Inclusion a” (NIa) endoprotease (TEV protease) and the Chlamydomonas
reinhardtii I-CreI homing endonuclease (I-CreI meganuclease). For this purpose FoldX
was used, a protein design algorithm developed in our laboratory, which is based on
physical and empirical parameters and which uses the protein structure to perform
mutations and theoretical energy calculations.
The TEV protease recognizes and cuts specifically a canonical amino acid
sequence, and is commonly used as a molecular tool in protein purification. The aim was
to change the recognition site of this enzyme in order to direct the cleavage to specific
sequences of interest, thus increasing its applicability.
Secondly, meganucleases are sequence specific dimeric endonucleases with large
palindromic cleavage targets. The meganuclease I-CreI was designed to avoid the
formation of homodimers and to favour the formation of obligate heterodimers. This
approach enormously increases the repertoire of non-palindromic unique target sites on
the genome that can be recognised by artificial enzymes. Such redesigned enzymes could
be used in a wide range of applications, including the correction of mutations responsible
for inherited monogenic diseases.
In summary, this thesis shows that computer-aided protein design is an effective
tool in developing enzymes “a la carte” and has great potential for providing new
molecular tools and biotherapies
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